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對于成功的BNCT方法，腫瘤中應積累足夠的硼10原子，并且通過熱中子輻照誘導其細胞毒性的功效需要進一步提高。BNCT的功效依賴于相對高的量的遞送硼10原子至靶細胞;據(jù)估計，每克腫瘤必須遞送約30μg的硼10原子，以維持致命的腫瘤細胞損傷。因此，已經基于靶向方法開發(fā)了第三代遞送系統(tǒng)，包括綴合腫瘤受體特異性抗體或配體以進行主動靶向以及使用高分子量遞送劑，例如碳納米管，脂質體，膠束，樹枝狀大分子和其他人造納米粒子，形成主動和被動靶向的受體配體。因此，已經廣泛開發(fā)了第三代遞送系統(tǒng)，尤其是針對靶向細胞質膜的癌癥受體。但是，細胞內靶向，例如靶向細胞器，很少用于BNCT研究。當由BNCT引起的細胞器損傷誘導細胞死亡時，細胞死亡的效率和途徑可能受到受損的細胞器的影響。在這里，硼中子研究網旨在利用細胞穿透肽開發(fā)BNCT技術15增強了硼化合物的細胞攝取及其在細胞內的受控定位。硼中子研究網評估了硼化合物在其受控的細胞內位置對BNCT后生物學活性的影響。

在這項研究中，硼中子研究網設計并合成了靶向細胞器的肽共軛硼簇，以增加其細胞攝取并控制其細胞內位置，從而在BNCT下誘導復雜的癌細胞殺傷活性。硼中子研究網采用了三種類型的CPP，以增強細胞對硼化合物的攝取，細胞膜滲透和受控的細胞內定位。八-精氨酸是典型的富含精氨酸的CPP。CPP被各種類型的單元通過內吞途徑，特別是通過巨胞吞作用，以及通過內體逃逸或直接質膜穿透而使肽類細胞質釋放。在這項研究中，硼中子研究網使用R8的D對映體防止肽水解酶消化肽。對于線粒體靶向，硼中子研究網以前開發(fā)質膜滲透的，線粒體靶向肽和RLA。使用KLA的D-對映體。因為精氨酸殘基在肽序列在細胞膜滲透性發(fā)揮關鍵作用所述的CPP的，的取代D賴氨酸在KLA用肽D-精氨酸產生具有高線粒體靶向能力和高質膜滲透性的新型載體肽。由于細菌和線粒體膜之間的相似性，已將20種抗菌肽用作凋亡誘導劑。線粒體內部具有負電壓，并且抗菌肽可能以電壓依賴性方式與線粒體膜相互作用。如“材料和方法”部分中所述，所有肽的化學合成都是通過Fmoc固相肽合成進行的。羧基十二硼酸鹽衍生物將N-末端的CPP的COOH被進行，以便完成綴合。

首先，硼中子研究網使用共聚焦激光顯微鏡檢查了CPP共軛對十二硼酸鹽的細胞攝取，胞質釋放和細胞內定位的影響。在含有D-MEM的D-MEM中，將C6膠質瘤細胞在37°C下用與RLA肽偶聯(lián)的熒光標記的十二硼酸酯處理30分鐘。共聚焦激光顯微鏡觀察前10％的胎牛血清。在DB-RLA的情況下，樣品被細胞攝取后，觀察到熒光帶狀線粒體結構，并且未確認到內體樣點信號。另一方面，在DB-r8的情況下，可以觀察到內體樣點和胞質熒光信號。使用抗十二碳酸酯抗體，硼中子研究網還檢查了無熒光標記的CPP綴合的十二碳酸酯的細胞攝取。在細胞固定之前，將C6膠質瘤細胞在10％含F(xiàn)BS的D-MEM中在37°C下用CPP結合的十二硼酸酯處理30分鐘，然后進行細胞固定，抗十二硼酸酯抗體的細胞染色和共聚焦激光顯微鏡觀察。即使在使用抗體的實驗中，也可以觀察到DB-RLA的線粒體積累和DB-r8的胞質釋放。DB-RLA的熒光信號與線粒體染色共定位。在DB-r8的情況下，即使在胞漿中存在熒光信號，也觀察到與MitoTracker染色缺乏共定位的現(xiàn)象。顯示了通過酶聯(lián)免疫吸附測定分析的C6神經膠質瘤細胞對內在硼的定量分析。在與圖S3a所示的相似的細胞攝取條件下，與沒有CPP綴合的BSH相比，RLA肽共降解的結合使細胞攝取增加了約4倍。綴合為十二酸酯的RLA肽也增加了細胞攝取功效。然而，與r8肽的綴合降低了細胞的十二硼酸鹽攝取?；旧?，寡精氨酸肽的細胞攝取功效顯示出S型增加，這取決于肽的濃度。帶負電荷的硼化合物與r8肽的結合可能會影響乙狀細胞攝取的增加，導致硼化合物的細胞攝取效率低下，盡管應進一步研究詳細的原因。對于BSH，細胞攝取BSH后，可通過共聚焦激光顯微鏡觀察到內體樣熒光點信號和與質膜的結合，表明每個CPP的共軛共分解都可以極大地控制硼化合物在細胞吸收后的細胞內位置。C6膠質瘤細胞的存活率沒有受到影響，如在用每種CPP綴合的十二硼酸鹽處理后通過WST-1分析進行分析。

硼中子研究網還檢查了DB-RLA肽在細胞攝取后對線粒體的保留。將C6膠質瘤細胞在37°C下用DB-RLA處理30分鐘后，洗滌細胞以去除未被細胞吸收的肽，然后用新鮮的細胞培養(yǎng)基處理細胞在37°C下放置24小時。使用共聚焦激光顯微鏡觀察表明，即使將細胞在無肽培養(yǎng)基中孵育24小時后，線粒體也能強烈保留DB-RLA。顯示了主要觀察到的熒光帶狀線粒體結構。相反，在DB-r8的情況下，在肽處理后可以觀察到肽的胞質釋放；然而，在細胞洗滌并在新鮮細胞培養(yǎng)基中于37°C孵育24小時后，僅觀察到非常弱的內體樣熒光點信號。這些結果表明，RLA肽具有很強的能力，可以在細胞膜穿透和線粒體積累后保留其在線粒體中的定位。

接下來，硼中子研究網檢查了每種CPP-十二硼酸酯結合物對熱中子輻照的影響及其通過BNCT殺滅細胞的活性。將C6膠質瘤細胞在10％含F(xiàn)BS的D-MEM中于37°C下用CPP結合的十二硼酸酯處理30分鐘后，在室溫下用熱中子照射細胞90分鐘。如材料和方法部分中所述，通過集落分析評估細胞活力7天。在BSH的情況下，高濃度的BSH顯示出較弱的細胞殺傷活性。較低濃度的DB-r8表現(xiàn)出與BSH相似的殺細胞活性。DB-RLA處理與其他CPP綴合的十溴酸鹽相比具有高的細胞殺傷活性。這些發(fā)現(xiàn)表明，將CPPs結合到十分解代謝物上可增強其細胞膜滲透性和胞質定位，特別是在將RLA肽用于線粒體積累時，可通過熱中子輻照有效地提高十二分解代謝物的細胞殺傷活性。

為了了解為什么DB-RLA的治療在熱中子輻照后顯示很好的細胞殺傷活性，硼中子研究網評估了細胞死亡途徑。圖S6a顯示了在37°C下在含10％FBS的D-MEM中對每種十二水合物處理30分鐘后，C6膠質瘤細胞中的胱天蛋白酶3/7活性。胱天蛋白酶3和7是細胞凋亡的指示劑，并且用BSH和熱中子輻射處理并未增加胱天蛋白酶3的活性。另一方面，BSH，DB-r8和DB-RLA的每種處理均類似地增加了caspase3/7活性，盡管DB-與熱中子輻照后的其他樣品相比，RLA具有高的細胞殺傷活性。硼中子研究網還檢測了早期細胞凋亡中質膜上磷脂酰絲氨酸的含量。圖S7顯示了使用FITC標記的膜聯(lián)蛋白V檢測C6膠質瘤細胞膜上的PS，以及對BSH，DB-r8和DB-RLA的處理同樣在熱中子輻照后增加了質膜上結合的FITC標記的膜聯(lián)蛋白V的熒光強度。硼中子研究網還評估了C6膠質瘤細胞中5'-三磷酸腺苷的含量，因為線粒體在細胞能量代謝中起著基本作用，并且是ATP的主要產生者，這對于維持細胞體內穩(wěn)態(tài)非常重要。DB-r8顯著降低了細胞ATP含量，用DB-RLA處理后，ATP含量進一步降低。這些結果表明，RLA肽可以通過細胞膜從細胞外部將十二硼酸轉移至線粒體，導致熱中子輻照后ATP含量降低和有效的細胞殺傷活性。ATP含量降低可能是細胞殺傷活性的關鍵因素之一。但是，需要進一步的實驗來闡明詳細的機制。據(jù)報道，硼化合物處理和熱中子輻照引起的細胞凋亡具有增加的細胞凋亡標記。蛋白質組學分析表明，內質網中的蛋白質功能，DNA修復和RNA加工通過熱中子輻照導致顯著變化。硼化合物處理和熱中子輻照誘導壞死的報道也有報道，但是BNCT中壞死誘導的詳細機制仍然未知。在這項研究中，DB-RLA的處理顯示出比DB-r8的ATP含量進一步降低，并且在DB-RLA和DB-r8的處理中證實了類似水平的caspase3/7活性。ATP耗竭誘導壞死，表明壞死不需要細胞內ATP。由于已經報道了阻止線粒體ATP產生的線粒體膜電位的喪失是凋亡的早期步驟，因此必須通過糖酵解來提供其余細胞凋亡過程所需的細胞內ATP。BNCT中的DB-RLA可能會增強壞死，應研究詳細的機制。

在這項研究中，硼中子研究網使用CPP實現(xiàn)了十二烷基酸酯的局部細胞內遞送，并發(fā)現(xiàn)由于特定的細胞殺傷途徑，這種在細胞內的受控遞送對于有效誘導BNCT的細胞殺傷活性非常重要。硼中子研究網的發(fā)現(xiàn)不僅將有助于BNCT的發(fā)展，而且還將有助于其他治療技術的發(fā)展。硼中子研究網強調了以細胞器為目標的系統(tǒng)對實現(xiàn)治療分子的復雜生物學活性的重要性。

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