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研究機(jī)構(gòu)已廣泛探索了使用聚碳酸酯作為NTD在組織水平進(jìn)行中子放射自顯影的不同方法。定性中子放射自顯影和定量中子放射自顯影已被應(yīng)用到不同的生物模型BNCT研究?；谘芯咳藛T在聚碳酸烯丙二酯碳酸酯上的工作，硼中子俘獲治療研究機(jī)構(gòu)的研究小組還報(bào)告了通過以下方法在聚碳酸酯上獲得蜂窩狀輪廓的可行性。UV-C曝光，采用與擴(kuò)大核徑跡相同的蝕刻程序。為了建立在聚碳酸酯基底上的細(xì)胞培養(yǎng)條件，進(jìn)行了不同的實(shí)驗(yàn)。此外，設(shè)置了條件以同時(shí)可視化來自BNC反應(yīng)的細(xì)胞印跡和核徑跡。另一方面，硼中子俘獲治療研究機(jī)構(gòu)小組報(bào)告了通過UV-C輻射降低了敏化聚碳酸酯箔的核徑跡密度。對(duì)于來自BNC反應(yīng)的離子，軌道密度與暴露于UV-C的時(shí)間之間的關(guān)系逐漸減小，并且發(fā)現(xiàn)增加UV-C的暴露時(shí)間會(huì)使Vb增大至飽和。

根據(jù)下面中的關(guān)系，通過測(cè)量不同厚度下的去除材料厚度，確定聚碳酸酯箔UV-C暴露2和5分鐘的整體蝕刻速率Vb。

在蝕刻過程之前,用環(huán)氧樹脂部分覆蓋聚碳酸酯箔的表面,從而在聚碳酸酯箔上形成臺(tái)階。H的測(cè)量是通過微納技術(shù)部的表面輪廓儀進(jìn)行的。將H的測(cè)量值與硼中子俘獲治療研究機(jī)構(gòu)小組報(bào)告的未曝光箔和“30minUV-C”條件下的測(cè)量值進(jìn)行比較。

為了表征在具有細(xì)胞印跡的放射自顯影圖像中對(duì)核徑跡的衰落效應(yīng)，進(jìn)行了定性和定量的徑跡密度分析。在沒有細(xì)胞印跡的核徑圖像上評(píng)估褪色效果。為此，選擇了具有均勻硼分布的參考樣品。隨后，對(duì)具有細(xì)胞印跡的放射自顯影圖像進(jìn)行了研究。由于與硼摻入有關(guān)的生物學(xué)變異性，這種條件在核徑跡分布中具有固有的異質(zhì)性，必須進(jìn)行進(jìn)一步分析。

將與聚碳酸酯箔接觸的硅標(biāo)準(zhǔn)NIST2137中的10B植入物暴露于中子注量下。這種能量密度足夠低，可以避免核跡線重疊，從而可能危害單個(gè)計(jì)數(shù)。中子輻照后，將箔片暴露于UV-C輻射5分鐘或30分鐘，然后進(jìn)行化學(xué)蝕刻。作為參考，將這些箔與無UV-C暴露條件進(jìn)行了比較。獲得了核徑跡的顯微照片，并按《成像與分析》中的詳細(xì)說明進(jìn)行了分析。

用光學(xué)顯微鏡與CCD相機(jī)耦合獲得顯微照片。設(shè)置光照條件以獲得質(zhì)量和可再現(xiàn)的圖像。

為了量化放射自顯影圖像的徑跡密度，必須識(shí)別并計(jì)數(shù)核徑跡。使用軟件ImageProPremier?進(jìn)行了圖像分析過程9.2。首先將基于閾值的圖像分割應(yīng)用于每個(gè)灰度圖像。然后，基于手動(dòng)選擇的參考對(duì)象的學(xué)習(xí)分類方法被應(yīng)用，以區(qū)分核徑跡坑與在分割過程中獲得的其他對(duì)象。先前已經(jīng)研究了與區(qū)分核徑跡有關(guān)的多個(gè)參數(shù)，包括面積，圓形度和縱橫比，用于訓(xùn)練算法。進(jìn)行了培訓(xùn)，以測(cè)量用戶手動(dòng)選擇的幾個(gè)對(duì)象中的這些參數(shù)。通過將結(jié)果與手動(dòng)計(jì)數(shù)進(jìn)行比較來驗(yàn)證此過程。

為了保證細(xì)胞在聚碳酸酯上的附著力，硼中子俘獲治療研究機(jī)構(gòu)首先測(cè)試了不同的預(yù)處理?xiàng)l件。選擇PBS條件進(jìn)行預(yù)處理，因?yàn)榕c對(duì)照樣品相比,它對(duì)細(xì)胞附著和生長(zhǎng)或形態(tài)的影響可忽略不計(jì)。其他策略導(dǎo)致明顯的細(xì)胞死亡或異質(zhì)生長(zhǎng)。該固定方案實(shí)現(xiàn)了良好的細(xì)胞結(jié)構(gòu)維護(hù)和質(zhì)量。

建立細(xì)胞附著和固定方案后，使用蘇木精染色進(jìn)行細(xì)胞印跡形成實(shí)驗(yàn)。觀察到使用蘇木精染色改變蝕刻和UV-C曝光時(shí)間的效果。顯示在暴露于UV-C之前用蘇木精染色5分鐘的細(xì)胞培養(yǎng)物。其他兩列顯示在不同蝕刻時(shí)間分別為2分鐘和4分鐘的描繪的同一區(qū)域的細(xì)胞印跡。連同蝕刻時(shí)間變化，與UV-C曝光時(shí)間相對(duì)應(yīng)的圖片顯示在不同的行中：15、30、60和120分鐘。

在UV-C照射之前使用蘇木精可以使細(xì)胞核與其他細(xì)胞區(qū)分開來。印記會(huì)在原始染色的細(xì)胞圖像中復(fù)制發(fā)現(xiàn)。將蝕刻時(shí)間從2分鐘增加到4分鐘會(huì)導(dǎo)致對(duì)比度增強(qiáng)，并在Lexan箔片上記錄“更清潔”的圖像。眾所周知，較長(zhǎng)的蝕刻時(shí)間會(huì)產(chǎn)生較大的核徑跡，從而使核徑跡與細(xì)胞痕跡更好地區(qū)分開。關(guān)于UV-C照射，隨著曝光時(shí)間增加，特別是30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，可以觀察到更加惡化的細(xì)胞印跡。這可能會(huì)損害突出細(xì)胞結(jié)構(gòu)的能力。此外，減少曝光時(shí)間對(duì)于軌道可視化至關(guān)重要。

考慮到先前的結(jié)果，然后通過將染色時(shí)間增加到15分鐘來研究2、5和15分鐘的照射時(shí)間。作為對(duì)照樣品，將一組Lexan箔片暴露于UV-C輻射，而無需蘇木精染色。正如硼中子俘獲治療研究機(jī)構(gòu)先前的工作所確定的那樣，細(xì)胞結(jié)構(gòu)以不同的水平吸收UV-C輻射，從而在蝕刻的檢測(cè)器表面產(chǎn)生浮雕。值得注意的是，細(xì)胞印跡是由每個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的UV-C吸收形成的。此外，通過將染色時(shí)間設(shè)置為15分鐘，可以注意到印記中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)在所有曝光時(shí)間內(nèi)均具有更大的對(duì)比度。對(duì)于建議的分析，在5分鐘和15分鐘內(nèi)獲得的結(jié)果在細(xì)胞室鑒定方面沒有顯著差異。期望通過減少曝光時(shí)間來減少軌道褪色，硼中子俘獲治療研究機(jī)構(gòu)放棄了15分鐘的UV-C。另一方面，盡管在2分鐘的曝光下產(chǎn)生的細(xì)胞印跡可以接受，但在5分鐘的曝光時(shí)間下，細(xì)胞印跡的圖像對(duì)比度似乎對(duì)于清晰識(shí)別結(jié)構(gòu)而言是很好的。

一旦建立了產(chǎn)生細(xì)胞印跡的參數(shù)，可以進(jìn)行評(píng)估同時(shí)顯示核徑跡和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)。蘇木精染色以及SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)物中相同區(qū)域的相應(yīng)細(xì)胞印記和核徑跡圖像可以被欣賞。必須強(qiáng)調(diào)的是，蘇木精染色圖像僅用于強(qiáng)調(diào)細(xì)胞印跡圖像與原始樣品之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在進(jìn)一步分析中，將不需要該圖像。可以觀察到，只要在顯微鏡焦點(diǎn)上稍作改變，可以實(shí)現(xiàn)軌跡或細(xì)胞印跡的可視化。這與以下事實(shí)有關(guān)：兩種損壞都發(fā)生在NTD材料結(jié)構(gòu)的不同深度處。

與僅由核徑跡形成放射自顯影圖像的NIST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的衰落分析相比，細(xì)胞印跡的研究更為復(fù)雜。在這些圖像中，必須區(qū)分被歸類為來自BNC反應(yīng)的跟蹤坑的對(duì)象和與細(xì)胞印跡結(jié)構(gòu)相關(guān)的對(duì)象。

對(duì)象分類學(xué)習(xí)算法如何處理具有BNC反應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞中的核徑跡的樣品。存在10在細(xì)胞內(nèi)的B原子可以通過在核軌道在兩個(gè)圖像中不具有和具有細(xì)胞壓印?？梢岳斫?，藍(lán)色物體被分類為“核跡”，而綠色物體被分類為“其他物”。那些不用于軌道密度測(cè)量。

相對(duì)于沒有UV-C暴露5分鐘的UV-C的磁道密度值。無論使用蘇木精染色，都可以觀察到軌跡密度的損失。此外，在無蘇木精染色條件下，這種損失更大。應(yīng)當(dāng)注意，在這些樣品的磁道密度測(cè)量中發(fā)現(xiàn)的分散度與測(cè)量方法無關(guān)，而與與細(xì)胞接種和硼吸收相關(guān)的生物學(xué)變異性有關(guān)。同樣，定性地比較了30分鐘的UV-C曝光時(shí)間與5分鐘的UV-C曝光時(shí)間，光道密度的損失顯著，核徑跡更小，對(duì)比度更差。無需進(jìn)一步的定量分析即可證明在30分鐘內(nèi)觀察到的顯著褪色效果。

在國(guó)家原子能委員會(huì)的阿根廷硼中子俘獲治療項(xiàng)目的框架內(nèi)，一項(xiàng)研究項(xiàng)目旨在研究將BNCT應(yīng)用于治療HER-2乳腺癌亞型局部復(fù)發(fā)的可行性。發(fā)展。該策略考慮了免疫脂質(zhì)體作為硼載體納米載體的設(shè)計(jì)和使用，以靶向HER-2過表達(dá)的細(xì)胞，這是一個(gè)范例案例研究。在這種情況下，中子放射自顯影與UV-C敏化相結(jié)合將使對(duì)硼納米載體傳輸性能的研究?jī)?yōu)化。

為了建立用于該應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)條件，在當(dāng)前研究中選擇了SK-BR-3和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系。成功為SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系建立了在聚碳酸酯檢測(cè)器上的細(xì)胞接種和生長(zhǎng)條件。當(dāng)與其他細(xì)胞系一起工作時(shí)，所描述的協(xié)議可能會(huì)有所不同。實(shí)際上，在先前用黑素瘤細(xì)胞系進(jìn)行的工作中，必須在培養(yǎng)基上預(yù)處理24小時(shí)才能在Lexan上獲得足夠的細(xì)胞分布。

既定的方案也應(yīng)用于MCF-7乳腺癌細(xì)胞系，以測(cè)試硼中子俘獲治療研究機(jī)構(gòu)在另一種感興趣的細(xì)胞系上的建立。不僅獲得了高質(zhì)量的細(xì)胞生長(zhǎng)，而且獲得了清晰定義的印跡和核徑跡?？紤]到該技術(shù)在硼化合物性能評(píng)估中的潛在應(yīng)用，這是一個(gè)相關(guān)的問題。但是，更換細(xì)胞系時(shí)應(yīng)修改協(xié)議。

可以觀察到，由于各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)UV-C吸收的差異，細(xì)胞印跡形成與聚碳酸酯檢測(cè)器上的不均勻損傷有關(guān)，細(xì)胞核的吸收高于細(xì)胞質(zhì)。蘇木精的使用由于細(xì)胞核的優(yōu)先染色而突出了這種作用，因此可作為UV-C“保護(hù)劑”。然后，當(dāng)先前使用蘇木精時(shí)，僅5分鐘的UV-C曝光足以獲得高質(zhì)量的壓印圖像。與先前研究中應(yīng)用的6hUV-C暴露相比，這一事實(shí)表明輻照時(shí)間大大減少。

此外圖像中可以看到蘇木精的“保護(hù)”作用。將固定在聚碳酸酯檢測(cè)器上的SK-BR-3細(xì)胞用蘇木精染色5分鐘，然后暴露于UV-C2或6h。將檢測(cè)器蝕刻2分鐘。在UV-C暴露2小時(shí)后，可以區(qū)分細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。盡管細(xì)胞質(zhì)輪廓定義不清，但有可能使細(xì)胞彼此區(qū)分。甚至可以觀察到核內(nèi)對(duì)比度較高的區(qū)域，因?yàn)樗鼈儗?duì)蘇木精的吸收更大。另一方面，在紫外線-C照射6小時(shí)后，觀察到蘇木精染色較少的細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失了，而染色染色較大的結(jié)構(gòu)則保持了清晰的輪廓。

關(guān)于細(xì)胞印記與核徑跡的可視化，除2分鐘的UV-C暴露時(shí)間外，在所有研究條件下均獲得了對(duì)比度良好的圖像。此外，對(duì)于5分鐘到30分鐘的UV-C照射時(shí)間，可以觀察到質(zhì)量的圖像。在該范圍內(nèi)，印記沒有明顯的差異。對(duì)于大于30分鐘的曝光時(shí)間，觀察到輪廓變差并因此失去了對(duì)比度。

考慮到發(fā)現(xiàn)對(duì)核徑跡的褪色效應(yīng)與UV-C照射時(shí)間有關(guān)，因此選擇了短的暴露時(shí)間以在不影響細(xì)胞印跡質(zhì)量的情況下減少這種影響。實(shí)際上，觀察到在30分鐘的UV-C照射下軌道密度降低和軌道質(zhì)量下降。這是一個(gè)重要的問題，在嘗試對(duì)UV-C敏化后的未知樣品的徑跡密度進(jìn)行定量時(shí)，必須考慮到這一點(diǎn)。

從NIST標(biāo)準(zhǔn)分析中可以看出，減少UV-C暴露時(shí)間對(duì)核徑跡密度有直接影響。但是，當(dāng)沒有生物材料保護(hù)檢測(cè)器時(shí)，UV-C暴露5分鐘會(huì)損失幾乎一半的核徑跡。當(dāng)生物基質(zhì)與檢測(cè)器接觸時(shí)，可以觀察到相對(duì)磁道密度略有增加。此外，蘇木精的保護(hù)作用也會(huì)影響軌道密度。當(dāng)在照射前進(jìn)行染色時(shí)，保留了約75％的核徑跡。但是，由于生物學(xué)上的可變性，該值不能視為恒定值。顯示了在染色條件和5分鐘的UV-C暴露下的跡線密度測(cè)量。在分析的不確定性范圍內(nèi)，不同樣品中存在類似的磁道密度損失。

在這項(xiàng)工作中，硼中子俘獲治療研究機(jī)構(gòu)建立了實(shí)現(xiàn)高對(duì)比度細(xì)胞印跡和核跡線的參數(shù)。區(qū)分細(xì)胞區(qū)室的能力對(duì)研究微量劑量法非常重要，因?yàn)閼?yīng)該知道細(xì)胞中核徑跡的分布。在那種情況下，將需要單獨(dú)的核徑跡計(jì)數(shù)，以便在細(xì)胞室之間進(jìn)行精確的徑跡密度確定。進(jìn)一步的分析可以得出更精確的結(jié)果。這項(xiàng)研究超出了這項(xiàng)工作的范圍，但是可以通過已建立的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。

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